5. - DONNÉES COMPLÉMENTAIRES SUR L'ENVIRONNEMENT -

5.1. - RENSEIGNEMENTS METEOROLOGIQUES -

Au moment de l'observation de Monsieur COLINI, jeudi 8 Janvier 1981 vers 17 heures, les conditions météorologiques étaient les suivantes à la station la plus proche ( 17 km au Sud-ouest du lieu de l'observation ) :

température : 6°8

humidité : 30%, pas de précipitations

vent : Sud Est à 2 m/s

nébulosité : 2/8

bonne visibilité

Par la suite, des précipitations importantes ont eu lieu pendant le week-end ( 10 et 11 janvier ).
Par contre, jusqu'au 17 Février, date de l'enquête GEPAN, il n'y a plus eu de nouvelles précipitations, ce qui a contribué sans doute à ce que la trace reste visible jusque là et permis au GEPAN de faire des prélèvements significatifs d'échantillons.

5.2. - RENSEIGNEMENTS SUR L'ACTIVITE AERIENNE -

Après avoir demandé des renseignements aux autorités civiles et militaires de la région concernant la circulation aérienne au-dessus de la localité de A1, il nous a été indiqué, après enquête ( par l'ALAT ) qu'il apparaissait seulement qu'un vol d'hélicoptère Alouette II avait survolé cette région, à une hauteur de 200 m du sol aux environs de 16h30 locales le 8 Janvier 1981.

5.3. - RENSEIGNEMENTS DIVERS -

La localité de A1 est située au Sud dune région où est implanté un des plus grands camps de manœuvre français le camp de JOUVAN Nous avons alerté les autorités militaires pour savoir s'il y avait eu une activité particulière ce jour là.

Au JOUVAN, la seule activité notable à l'heure de l'observation a été un tir de canon de char à obus inerte à courte portée, exécuté face à l'Ouest sur un champ de tir situé à plus de 25 km au Nord de A 1.

6. - ANALYSE DES ÉCHANTILLONS DE SOL -

6 .1 - DETAIL DES ANALYSES -

Le tableau ci-dessous présente les caractéristiques des deux types d'échantillons prélevés :

Les analyses ont débuté par un examen visuel grossier et global à la loupe binoculaire puis, plus précisément, après le choix de zones présentant des aspects particuliers, au microscope.

Cette première étape a été réalisée dans un laboratoire du CNES sur l'échantillon P1.

Dans une seconde étape, les échantillons ont été confiés à différents laboratoires d'analyses physico-chimiques afin de :

déterminer la structure et la composition des éléments constituant les échantillons P1 et P2 ;

analyser et interpréter les différences éventuelles de composition, de structure, etc... entre les deux échantillons pour tenter de mettre en évidence des effets et des actions ( mécaniques, thermiques, radiatives, etc... ) pouvant être à l'origine de ces effets.

– ANALYSE VISUELLE ET AU MICROSCOPE EFFECTUEE AU CNES –

Une série de photographies ont été prises à l'aide d'un microscope optique à faible grossissement.
L'échantillon P1 a été divisé en deux parties :

P1a et P1b qui ont donné respectivement lieu à 2 et 3 photos aux grossissements variés ( paramètre G ).

ECHANTILLON P 1 a :

La photographie N°14 ( échantillon P1a ) est prise à l'échelle 1 (G = 1).
Deux morceaux importants figurent sur cette photographie.
Cette terre fortement compactée ( croûte épaisse de 6 à 7 mm ) à prédominance calcaire, d'un aspect très sec, ne laisse apparaître que quelques traces de végétation ( mousse desséchée ).

En surface, des stries courbes apparaissent, en clair sur la photo, et montrent que cette terre a subi un frottement en surface qui a retiré des grains de silice ( effet de ponçage ).

La photographie N°15 montre avec un grossissement G = 6,4, une partie agrandie de l'échantillon P1a.
On note la présence ( partie gauche ) d'un silex qui a été non seulement enfoncé, mais également arasé jusqu'au niveau de la terre.

On peut distinguer de part et d'autre de ce silex une ligne de fracture du sol, peut être due à faction conjuguée d'une pression mécanique alliée à un échauffement du sol.

Par contre, la partie droite de la photo N°15 paraît plus sombre et contient de petites pousses végétales ayant sans doute germé après le recueil de l'échantillon, l'effet de ponçage apparaît moins évident.

ÉCHANTILLON P1a
G = Grossissement à la loupe binoculaire

 PHOTO 14(G = X 1)
 
 PHOTO 15 (G = X 6,4)
 

ECHANTILLON P1b :

La photo n°16, grossissement G = 1, présente des morceaux de terre prélevés sur la même portion de la couronne et l'aspect de compression semble le même sur le morceau de gauche où les striures sont également visibles.

Mais surtout sur cette zone nous notons la présence dune partie sombre qui pourrait correspondre à un apport, voire à une transformation en surface, de matériaux.

Cet aspect est nettement visible sur les photos 17 et 18, à grossissement G = 5 et G = 13.

On peut voter la présence sur la photo 18 d'un début de germination de végétaux, qui repousse le dépôt noir.

- ANALYSES PHYSICO-CHIMIQUES AU LABORATOIRE DE LA SNEAP -

Ce laboratoire est habituellement chargé par le GEPAN des premières analyses pour déceler et identifier la présence de corps ou de matériaux organiques et minéraux.

Le laboratoire a procédé à deux types d'analyses l'une portant sur le dépôt noirâtre visible, l'autre sur la surface laissant apparaître des stries.

( échantillon P1b ).

Par dilution dans des révélateurs il a été possible de constater qu'il n'y avait pas de composés organiques décelables caractéristiques de produit de combustion des moteurs utilisant des hydrocarbures.

A l'aide dune microsonde électronique (CAMERA) portant toujours sur les mêmes échantillons (P1b) il a été possible de mettre en évidence la présence de fer.

Cependant, cette mesure ne permettait pas la détermination de cet élément sous forme fer libre ou oxyde.
Ce composé métallique est plaqué sur les grains de roche calcaire en stries avec une épaisseur de l'ordre du micron.

Le fer n'est pas accompagné des Cr, Mn, Ni, etc. souvent utilisés dans les aciers.

- ANALYSE AU LABORATOIRE DE MICROSCOPIE ET STRUCTURE DES MATERIAUX -
- ( UNIVERSITE PAUL SABATIER DE TOULOUSE ) -

Faisant suite aux premières analyses réalisées au laboratoire de la SNEAP, une étude plus approfondie est entreprise par dissolution des échantillons dans l'eau, dessiccation ( dispersion par ultrason ) et diffraction électronique.

L'analyse de l'échantillon P2 laisse penser qu'il y a coexistence d'au moins trois composés :
BaCa(CO3)2, (Ca02, 8H20) et en moindre quantité Fe304, ( les deux premiers pouvant résulter du mode de préparation ).

Sur l'échantillon P1b, il apparaît une plus grande concentration de Ca02, 8H20 sous forme cristalline.
Par contre l'un au moins des constituants de cet échantillon est dans un état monocristallin alors que cet état n'était pas constaté dans la terre de référence ( échantillon P2 ).

- ANALYSE AU LABORATOIRE DE L'UNIVERSITE DE METZ -

De manière à permettre un recoupement entre les analyses réalisées sur les échantillons, nous avons confié à des laboratoires différents le même type de problème à résoudre.

Le laboratoire d'analyse commun de la Faculté de METZ a reçu une partie des éléments de sol ( témoin et portion de couronne indurée ).

Pour permettre une identification des composants, ce laboratoire a fait une analyse en spectrométrie de masse par bombardement ionique du substrat.

Sur l'échantillon prélevé sur la couronne :

-- En ion négatif :

Sur les particules noires macroscopiques (100 microns) on note la présence de C2H20 avec une section efficace importante.

On note aussi la présence des ions 63 et 79 typique de l'ion phosphate.

Les spectres négatifs ainsi obtenus présentent des analogies avec ceux de certains polymères ou de résidus pétroliers.

-- En ion positif :

Les particules noires se distinguent de la terre environnante par l'absence d'aluminium.
Le sodium, le magnésium, le titane sont en très faible quantité, le calcium étant l'élément majoritaire.
Par ailleurs, la présente d'autres fragments mentionnés en ions négatifs confirme l'existence dune matrice carbonée polymérique.

En conclusion, les particules noires macroscopiques semblent être des résidus de combustion.

– ANALYSE DES ECHANTILLONS DE SOL AU LABORATOIRE D'ANALYSE PHYSIQUE DE PAU -

Ce laboratoire est spécialisé dans l'analyse de traces physico-chimiques sur les matériaux minéraux et organiques.

Il est bien connu des services du CNES depuis que, il y a quelques années il avait effectué l'analyse des éléments du sol lunaire, à partir d'échantillons fournis par la NASA.

Le laboratoire d'analyse physique utilise un spectromètre de masse à étincelles.

Les échantillons de sol analysés ont été prélevés sur ceux fournis aux laboratoires précédents.
Cette analyse révèle une qualité de sol banale, argilo-calcaire.

Les résultats montrent qu'il y a peu de différence significative entre le sol témoin et le sol sur lequel un dépôt est visible.

Les seuls éléments quantitativement décelables sont le zinc et le phosphate.
Le laboratoire interprète ceci comme pouvant provenir dune peinture noire primaire à base de Carbon black.

6.2. - SYNTHESE DES ANALYSES DE SOL –

Les méthodes d'analyse et d'observation microscopique ont mis en évidence des éléments indiquant que la partie du sol où Monsieur COLINI déclare avoir observé le phénomène, a subi diverses modifications, par exemple :

un effet mécanique -

En observant les photographies 14 et 15, nous constatons que les zones claires et sombres correspondent à des stries courbes dont le contour assez précis (sillons) peut évoquer un effet de matissage.

De même, un silex apparaît coupé sur la tranche et même avoir subi un polissage en surface.
Le sol semble particulièrement compacté à cet endroit. La terre prélevée dans cette zone présente une dureté, une consistance importante (croûte), ce qui n'est pas du tout le cas de la terre témoin qui au contraire présente un aspect friable.

un effet thermique -

Le laboratoire de la SNEAP estime qu'il y a eu chauffage lors du frottement car le grès est plus solide sous la trace noire de fer ( ou d'oxyde de fer ) qu'à côté. De plus, les grains de CO3Ca ne sont pas "foisonnants".
Ils n'ont donc pas été échauffés à une température supérieure à 600°, ce qui aurait provoqué la dissociation de C03Ca, puis sa recombinaison, avec efflorescence "foisonnante".

Par ailleurs, le laboratoire de la Faculté de Rangueil a tenté sans succès de reproduire une monocristallisatisation des composés du sol par chauffage à 1 000° sur 2 heures.

Ainsi l'ensemble des analyses peut se résumer selon le tableau ci-après et les constatations suivantes :

une forte pression mécanique a été exercée (probablement due à un choc) en surface ;

l'apparition d'une modification de structure superficielle du sol (stries et érosion) ;

un échauffement thermique du sol, peut-être consécutif au choc, dont la valeur n'a pas excédé 600°.

un éventuel apport de matériaux sous forme de traces décelables sur les échantillons analysés tel qu'une faible quantité de fer ou d'oxyde de fer sur grain de calcaire, et une faible quantité décelée de phosphate et de zinc.

TABLEAU RECAPITULATIF DES ANALYSES AYANT ETE EFFECTUEES SUR LES PRELEVEMENTS.

LABORATOIRE
 TYPE D'ANALYSE
 RESULTATS
 INTERPRETATION ENVISAGEE
 
SNEAP de BOUSSENS
 - physico-chimique

- visuelle

- microsonde électronique
 Pas de trace organique
Dépôt de matière
Présence de fer libre ou d'oxyde de fer. Corps de masse importante ayant frotté le sol, et laissé un dépôt en évidence d'un effet thermique et mécanique.
Faculté de Rangueil
Physique et Structure des matériaux Micro-diffraction d'électrons. Présence d'un composé monocristallin qui n'est pas retrouvé dans le sol.  
Laboratoire LAMMA
Faculté de METZ Spectrométrie de masse ionique en surface et en profondeur. Apparition des masses 63 et 79 typiques des phosphates ainsi qu'une matrice carbonée polymérique. Possibilité de résidus de combustion.
Laboratoire LDP de PAU. Spectrométrie de masse à étincelles. Identification de tous les composés présents dans le témoin et le sol marqué.
Apport de phosphate et de Zinc. Trace laissée sur le sol pouvant provenir d'un revêtement primaire (peinture) ayant été frotté.

7 - ANALYSES BIOCHIMIQUES DES ÉCHANTILLONS DE VÉGÉTAUX -

Cette partie de l'enquête a été prise entièrement en charge par le Docteur BOUNIAS du Laboratoire de Biochimie à l'Institut National de la Recherche Agronomique ( Centre d'AVIGNON-MONTFAVET ).
Il a lui-même rédigé une synthèse des travaux qu'il a effectués ce jour ( Mars 1983 ) et c'est son texte qui constitue les sections suivantes (7.1. à 7.5).

7.1. – INTRODUCTION -

A la suite de l'observation d'un "objet non identifié" le 8.1.1981, dans des circonstances précédemment décrites, ( voir les différentes parties de l'enquête ), des prélèvements de végétaux ont été effectués en vue dune analyse biochimique des conséquences éventuelles du "phénomène".

Différentes sortes de traumatismes physico-chimiques peuvent, en effet, se manifester à plusieurs niveaux :
effets primaires des radiations sur les péroxydases et les co-facteurs d'oxydoréduction (GIACOMELLI et al., 1964, Rad. Bot., 4, 395-403) ainsi que sur les pigments chlorophylliens et caroténoidiens (BOUNIAS, 1973, Arabidopsis Inf. Serv., 10, 26-28) ; effets des "chocs hydriques" sur les péroxydases, les glucides et les aminoacides (THAKUR, 1981, New Phytol., 89, 25-32 ; 1980, Biol. Plant., 22, 50-56 ; 1982, Environ Exp. Bot., 22, 221-226) ; effets de la température et de l'éclairement sur les interrelations entre pigments photosynthétiques et aminoacides libres (BOUNIAS, 1972, Thèse Doctorat ès Sciences, LYON 1, n°98, 262 p. et 1975, Can. ,J. Bot., 53, 708-719).

Les résultats numériques présentés ici constituent la première partie des Recherches effectuées :
ils seront suivis d'une série de données complémentaires en cours d'analyse.

7.2. - PRÉLÈVEMENTS D' D'ÉCHANTILLONS -

Le principe consiste à choisir une même espèce, animale ou végétale, dont il soit possible de trouver une suite de "stations" écologiques situées sur un axe prenant son origine au centre du "phénomène" et s'éloignant au maximum.

Les points les plus éloignés sont alors assimilables à des "Témoins" tandis que les points intermédiaires doivent permettre de détecter une éventuelle gradation des conséquences du "phénomène" jusqu' aux échantillons les plus exposés c'est à dire ceux qui sont situés dans le plus proche voisinage du point de "contact" ou de "rapprochement maximum", ce qui ne signifie pas que le maximum d' émission éventuelle d' une forme quelconque d' énergie soit forcément situé sous l'objet lui-même.

Dans le cas de l'observation du 8.1.81, les échantillons sont constitués par des plants d'une luzerne sauvage :
Medicago minima.

Deux séries de prélèvements ont été effectuées successivement :

Par la gendarmerie de A2

le 09 01.81 dans l'une des traces (1 m50 du centre) (jour J + 1)

le 23.01.81 à 20 m de la trace, au titre de témoin (J + 15)

Par le GEPAN : le 17.02.81 (J + 40)

les prélèvements sont effectués à partir du centre, sur la périphérie, et à des distances croissant jusqu'à 10 m du centre.

Leur disposition est illustrée par la figure 1.

fig 1 - Disposition des prélèvements
(schéma de principe)

Sélection des parties analysées :

Les deux critères ayant présidé au choix des fragments analysés sont Ies suivants :

Identité morphologique ( y compris la couleur ) des échantillons homologues provenant des divers points de prélèvements.

Répartition des éléments retenus pour analyse sur toute la surface des prélèvements.

Description des prélèvements analyses (d = distance du centre) :

1ère série : ( regroupement de fragments morphologiquement semblables )

N - 4 = feuilles âgées (d=1,5 m) : 103,78 mg sec   taille des feuilles
N - 11 = " (d=20 m) : 96,14 " "   15 à 20 mm
                     
N - 8 = jeunes feuilles (d=1,5m) : 51,7 mg sec   taille des feuilles
N - 15 = " (d=20m) : 25,14 " "   3 a 4 mm

2ème série : (entièrement constituée de jeunes feuilles)(taille 3 à 4 mm)

E - 1 = 8 feuilles (d~0) 76,8 mg frais P = 9,6 mg / feuille
E - 2 = 8 " (d~1,5m) 79,0 " " P = 9,88 "
E - 3 = 18 " (d=21 m) 52,0 " " P = 2,90 "
E - 4 = 16 " (d=3,5m) 45,0 " " P = 2,82 "
E - 5 = 8 " (d=10m) 96,0 " " P = 12,0 "
E - 6 = 15 " (d=10m) 73 " " P = 4,87 "

Les échantillons E-5 et E-6 encadrent les valeurs des poids moyens individuels de l'échantillon E-1.
La comparaison entre E-5 et E-6 pourra en outre rendre compte des effets éventuels imputables à la croissance des jeunes feuilles ( au cas où E-3 et E-4 , par exemple, présenteraient des anomalies inhérentes a leur moindre développement, lié au hasards de la distribution éco- physiologique ).

Relation poids frais / poids sec

Deux lots de 5 feuilles de la 2e série ont été desséchés à l'étuve ( 6 heures à 100°c ) :
le poids sec final représentait alors 28,5 ± 1,0% du poids frais.

7.3. – TECHNIQUES -

Les techniques d'extraction et de chromatographie des lipides ( dont les Pigments photosynthétiques ), des glucides et des aminoacides ont été décrites dans diverses publications :

M. BOUNIAS : Chimie Analytique, 1969, 51, 76-82 ;
Analusis, 1976, 4, 87-93 ;
Analusis, 1980, 8, 287-295 ;
Analusis, 1981, 10, 31-35,

ainsi que dans un ouvrage de l'auteur paru chez Masson éditeur en 1983 ( L'analyse biochimique quantitative par nanochromatographie en couche mince" - 204 pages - ISBN 2-225-78914-2 ).

Les dosages sont effectués après enregistrement des chromatogrammes au moyen d' un photomètre VERNON PHI-5 et d'un Spectro-Densitomètre à "balayage" CS-920.

Les calculs d'étalonnage sont effectués selon un protocole mathématique rigoureux ( sans aucun report graphique manuel ) comportant une courbe d'étalonnage spécifique pour chaque composant analysé ; dans le cas des glucides, la méthode bénéficie des performances d'un nouveau réactif chromogène mis au point par l' auteur ( M. BOUNIAS, Analytical Biochemistry, 1980, 106, 291-295 ).

Des dosages spectrophotométriques de pigments chlorophylliens ont été effectués à partir d'extraits de feuilles de blé pris comme étalons de référence.

Dans ce cas, les concentrations pigmentaires ont été calculées d'après les équations de COMAR et ZSCHEILE, in :

Rev. Cytol. Biol. Vég., 1959, 20, 1-160, de GOTTSCHALK et MULLER, Planta, 1964, 61, 259, VERNON, Anal. Chem., 1960, 32, 1144, toutes dérivant de celles de MAC KINNEY : J. Biol. Chem., 1941, 140, 315.

7.4. - RESULTATS -

- PIGMENTS PHOTOSYNTHETIQUES -

La figure 2 illustre un chromatogramme-type obtenu à partir de plants de Médicago minima situés au maximum de distance du "phénomène" (20m) et considérés comme Témoins de comparaisons - (N-15).

fig. 2 - Chromatogramme d'extrait pigmentaire de la 1ère série ( Phase chloroforme - sans révélation - Photomètre Vernon PHI-5 - lumière blanche ).

D = Dépôt (chlorophyllides + phéophorbides + tannins)
1 = Méthyl chlorophyllides
2 = Protochlorophyllides
3 = type lutéine-époxyde ou zéaxanthine
4 = type cryptoxanthine ou carotene-époxyde
5 = Oxy-chlorophylles
L = lutéine
B = chlorophylle B
A = chlorophylle A
P = Phéophytines
C = ß carotène
Vx = Violaxanthine
Nx = Néoxanthine

Le tableau 1 exprime en nanomoles par mg de tissus les résultats d'analyse des échantillons de la 1ère série.
Les coefficients de variation atteignent C = 0,22 pour 3 mesures.

Les différences d'équipement pigmentaire inhérentes au vieillissement ( abaissement des chlorophylles, augmentation des xanthophylles ) déjà observés chez l'orge ( BOUNIAS, Thèse 1972 ) se retrouvent ici sans équivoque dans les échantillons prélevés à 20 m.

Les échantillons provenant de la périphérie ( d~1,5m ) montrent un affaiblissement général des teneurs pigmentaires.

Quel que soit l'âge des feuilles, les chlorophylles A sont abaissées de 33%, les chlorophylles B de 28% et la phéophytine de 31% :

ces trois valeurs montrent une grande homogénéité.

Parmi les caroténoïdes, le plus affecté est le ß carotène qui est abaissé de 50 à 57% au voisinage du "phénomène", ainsi que la violaxanthine ( -80% chez les jeunes feuilles ).

Tableau 1 - Analyse des pigments dans les échantillons de la première série :
jeunes feuilles ( N-15=Témoin et N-8=exposées )

et feuilles âgées ( N-11=Témoins et N-4=exposées ).

Pigments  N - 15   N - 8   N - 11   N - 4 
Chlorophylle A 0,87 0,58 0,81 0,54
Chlorophylle B 0,62 0,45 0,51 0,37
(A + B) 1,49 1,03 1,32 0,91
Phéophytine A 0,73 0,44 0,29 0,20
ß Carotène 0,21 0,09 0,20 0,10
Lutéine 0,32 0,28 0,34 0,24
Violaxanthine 0,15 0,030 0,17 0,11
Néo-xanthine + chlorophyllides 0,28 0,30 0,26 0,25
Protochlorophyllide - - 9,9 6,0

Au cours de cette série d'analyses, il est apparu diverses formes isomères ou oxydées des chlorophylles A et B, ainsi que des phéophytines.

Les formes A' et B' semblent correspondre à des dérivés allomériques légèrement oxydés de polarité accrue, donc de mobilité chromatographique moindre, dont l'existence est connue depuis longtemps ( JOHNSTON et WATSON, 1956, J. Chem. Soc., p.1203 ).

Le dérivé B' peut se transformer réversiblement en sa structure initiale B, tandis que le passage de la forme A aux formes A' et A" s'est avéré irréversible.

La forme A" pourrait correspondre à l'une de celles décrites par STRAIN, 1955, J. Am. Chem. Soc., 11, 5195 et par FREED et al., 1954, J. Am. Chem. Soc., 16, 6006.

De telles transformations, également décrites dans le cas du méthyl-phéophorbide B par CONANT et al., 1930, J. Am. Chem. Soc. 52, 3013, pourraient affecter le cycle III du noyau porphyrinique selon le schéma suivant :

Ces modifications moléculaires se traduisent également par des modifications du spectre d'absorption.
Ces dernières sont de deux types : d'une part un décalage vers les courtes longueurs d'ondes et, d'autre part une augmentation du rapport des absorbances lambda 410 nm (bande de Soret) / lambda 677 nm (pic dans le "rouge"), qui peuvent être interprétés, selon STRAIN et al., 1963, B.B.A., 75, 306, comme l'indice de tendances à l'oxydation.

Les formes A et B présentent une mobilité chromatographique normale et la position des maxima de leur spectre est également conforme à celle des étalons.

Les formes A' montrent un léger décalage du pic "rouge" de 677 vers 675 nm.
Le rapport lambda 410 nm / lambda 677 nm y est élevé (supérieur à 2) et sa couleur est constamment plus forte dans l'échantillon 1(d=0) que - par exemple - dans l'échantillon 4(d=3,5m).

Compte tenu des relations entre la structure moléculaire et les propriétés physiques des chlorophylles ( STRAIN THOMAS & KATZ, 1963, B.B.A., 15, 306 ), cela semble traduire une tendance à l'oxydation :

d'un radical 3c-CH3 en 3c-CH=0 par exemple, de Chl. A à Chl. B

Peut-être d'un radical éthylène 2c-CH===2dCH2 en époxyde :

qui influerait alors peu sur la mobilité , masqué par les carbones alpha - 2a - 2b de la molécule.

La phéophytine A est surtout caractérisée au voisinage du "phénomène" par un abaissement du rapport lambda 410 / lambda 675.

Notons, enfin, que les relations "structures/spectres" sont extrêmement délicates à manipuler :
ainsi, les radicaux électrophiles de substitution exercent un effet bathochrome lorsqu'il s'appliquent aux carbones 2-6 et gamma et un effet hypsochrome en position 3 ... ( VERNON & SEELY, Op. cit. p.75 ; SEELY & JENSEN, 1965 , Spectrochim. Acta, 21, 1835 ).

Au niveau des caroténoïdes, la mobilité chromatographique n'est pas significativement affectée, mais l'analyse des spectres révèle parfois également une tendance à certaines modifications des structures moléculaires comme l'illustre la figure 4.

L'analyse comparée des divers extraits a montré que ces modifications structurales sont plus marquées dans les échantillons provenant du voisinage immédiat du "phénomène".

Les tableaux 2 et 3 précisent les résultats des analyses quantitatives effectuées à partir des différentes formes moléculaires séparées et identifiées d'après leur mobilités chromatographiques et leurs spectres respectifs.

Tableau - 2

Pigments   E-1      E-2      E-3      E-4      E-5      E-6   
Chlorophylle A 0,005 0,010 0,016 0,017 0,021 0,0082
Chlorophylle A' 0,353 1,08 1,14 1,17 1,25 1,28
Chlorophylle A" trace 0,008 0,0088 0,0116 0,0281 0,0398
Chlorophylle B 0,030 0,031 0,030 0,037 0,049 0,031
Chlorophylle B' 0,13 0,23 0,22 0,15 0,18 0,14
Phéophytine A' 0,174 0,21 0,16 0,12 0,098 0,026
Phéophytine A 0,27 0,50 0,61 0,58 0,53 0,50
ß carotène 0,090 0,106 0,12 0,158 0,195 0,251
Lutéine 0,089 0,087 0,123 0,140 0,175 0,287
Violaxanthine
+ Néoxanthine
+ chlorophyllides 0,327 0,538 0,468 0,746 0,592 0,655
Protochloroph. (4) 0,061 0,13 0,12 0,18 0,13 0,13
Protochloroph. (3) 0,071 0,23 0,21 0,20 0,16 0,16

Ces données numériques font apparaître différentes relations quantitatives entre les teneurs pigmentaires et la distance qui sépare les échantillons du point central du "phénomène".

Abréviations utilisées :

Chlorophylles f (d)

Les teneurs en chlorophylles (A) croissent en fonction de la distance (d) du centre du "phénomène" :
N = 6 ; rhô = + 0,6868 (rhô = 0,546) (Seuil de signification/calculatrice TI59 ; Programme 21 ; module "statistiques".)
(fig.5, voir plus bas).

La corrélation devient beaucoup plus étroite si l'on exprime les teneurs en fonction de l'inverse des distances, après changement de coordonnées tel que :

D = d + 1 (pour éviter 0-1) :

N = 6 ; rhô = 0,990 (P = 4,1.10-6)

(pente - 1,054 - intersections : 1,448 et 1,37)

Les chlorophylles B ne montrent pas de corrélation significative, mais la somme (A+B) conserve les mêmes propriétés (fig. 5, voir plus bas).

Le rapport SigmaChl.A / SigmaChl.B augmente également avec d (rhô = + 0,7509)

(rhô = 0,031) et la relation, comme précédemment, se rapproche de la linéarité en fonction inverse des distances : (d+1)-1

N = 6 ; rhô = - 0,891 (P = 0,0039)

(pente b = - 5,02 ; intersections : 6,925 et 1,37)

Chez diverses plantes, le rapport ChlA/ChlB diminue avec l'âge, tandis que les phéophytines tendent à s'accumuler ( BOUNIAS, Thèse 1972, n°98 ).

Ainsi, chez l'orge le rapport A/B passe de 4,13 (au stade 4 jours) à 1,52 (au stade 24 jours) et chez l'Arabidopsis : de 2,16 (au stade 13 jours) à 1,70 (au stade 25 jours).
Dans le même temps la teneur en phéophytines passe de 0 (à 13 jours) à 0,15 (à 24 jours) puis décroît en raison de la baisse de teneur en chlorophylles.

C'est ce que nous allons examiner également ici.

Phéophytines

Le tableau précédent montre que la teneur en phéophytine A' va en décroissant du point d = 1,5 (E - 2) au point d = 10 (E - 5 et E - 6).

Cette relation prend toute sa signification lorsque les phéophytines sont exprimées relativement aux concentrations en chlorophylles (A) dont elles sont issues :

il apparaît ainsi que dans l'extrait E - 1 (au centre du "phénomène") la proportion relative de phéophytines est de très loin au point maximum.

Les variations sont plus prononcées dans le cas du rapport Ph.A' / SigmaChlA que dans le cas de SigmaPh(A+A') / SigmaChlA (fig.6).

Lorsque ces rapports sont exprimés en fonction de (d+1)-1, celui qui englobe Ph(A+A') donne lieu à une relation linéaire :

N = 6 ; rhô = + 0,990 (P = 4.10-6)

Intersections : [ 0,359 ; - 0,41 ] (Fig. 6 E)

Par contre, dans le cas du rapport PhA' / SigmaChl(A) = f(d+1)-1, la courbe n'est pas complètement redressée quoique la corrélation reste très forte :

rhô = 0,993 (P = 1,4.10-6). (fig.6B)

La courbe peut être redressée de manière plus satisfaisante par l'emploi des coordonnées bi logarithmiques naturelles : la régression de

Ln (Ph A' / SigmaChl A) sur Ln (d+1) donne pour N = 5 ; rhô = 0,916 (P=0,28.10-3) Intersections : - 0,72 ; + 0,68 pente : b = - 1,06

Caroténoïdes

La figure 7 montre les variations respectives des concentrations en carotène et en Lutéine en fonction de d.
Les paramètres résultant du calcul de corrélation-régression linaire sont rassemblés dans le tableau ci-dessous :

Tableau 3 :

Paramètres statistiques ß carotène Lutéine
N = nombre de couples 6 6
Coeff. de corrél. rhô 0,945 0,871
Probab. signif. P 0,0022 0,012
Pente b 0,0130 0,0148
Intersections /x 0,094 0,083
               /y - 7,22 - 5.62
Point médian (x ; y) 0,15 / 4,51 0,15 / 4,51

fig. 5 - Modifications quantitatives affectant les chlorophylles A et B en fonction de la distance (d) au centre du "phénomène".

Fig. 6 - Modifications en fonction de la distance "d" de la proportion de phéophytines A et A' relativement à la chlorophylle A totale :

coordonnées naturelles (A-D) inverses (B-E) et bi-logarithmiques (C).

fig. 7 - Variations de concentrations en caroténoïdes en fonction de la distance d'au centre du "phenomène".

- AUTRES DERIVES CHLOROPHYLLIENS -

Cette série d'analyses (81-35) a permis, par ailleurs, de mieux caractériser deux dérivés chlorophylliens notés (1) et (2) sur la figure 2.

Les spectres respectifs de ces deux composés sont présentés sur la figure 8.
Le premier, de faible mobilité, devrait correspondre à un Méthyl chlorophyllide ( moins polaire que le chlorophyllide, en raison du radical méthyle ) et le second à un proto-chlorophyllide, ( forme réduite ) selon l'échelle des mobilités relatives de SCHNEIDER (Op. Cit. 1969).

Le Méthyl-chlorophyllide A présente au moins deux pics principaux à 427,5 et 660,5 nm ( PENNINGTON et al., 1964, J. Am. Chem. Soc., 86, 1418 ).

Le second composé présente une couleur bleue : son spectre se caractérise par l'absence ( ou le déplacement ) de la bande d'absorption dans le rouge.

Par comparaison avec un spectre de protochlorophylle dans le Méthanol, ( KOSKI, FRENCH & SMITH, 1951, Arch. Biochem. Biophys., 31, 1 ) il est possible de relever l'analogie des rapports d'absorption bleu/rouge :
6,6 pour la protochlorophylle contre 5,7 pour le dérivé étudié (*).

(*) Ces analogies s'étendent è la chlorophylle C de structure mal connue !
... Elles suggèrent également une structure de "porphine" plutôt que de "chlorine" ( JEFFREU, 1963, Biochem. J., 86, 313 ).

fig. 8 - Spectres de 2 dérivés chlorophylliens de polarités élevée (A) et faible (8) comparés aux spectres dans l'éther de l'éthyl chlorophyllide (C) des protochlorophylles (D---) et des protophéophytines (D---).

Toutefois, d'autres travaux montrent une disparition du pic 630 nm chez les protophéophytines dans l'éther ( KOSKI & SMITH, 1948, J. Am. Chem. Soc. 70, 3558 ).

(Fig.8 C et D).

Ce point est important eu égard aux voies de biosynthèse de la chlorophylle A dont WOLFF & PRICE, 1957, Arch. Biochem. Biophys., 72, 293, ont montré deux étapes photo-contrôlées de manières opposées :

Tableau 4

L'importance que nous pouvons attribuer à ces deux composés, que nous désignerons par MeChld et PrChid, tient à leurs variations en fonction de la distance des échantillons par rapport au centre du "phénomène".
(fig.9)

L'allure sigmoïde des graphes suggère une équation générale du type :

dans laquelle :

C = concentrations

D = (d+1) avec d = distance du centre du phénomène

k = constante dépendant de l' "affinité" entre le mécanisme et D

n = paramètre exponentiel

permet d'obtenir les courbes correspondantes : fig.9 C-D, les valeurs respectives de CM ayant été estimées à 2200 et 2600 après transformation en coordonnées inverses et extrapolation sur l'axe des ordonnées à partir des deux points les plus éloignés de l'origine ( cf. BOUNIAS, 1979, Comp. Biochem., 63B, 407-417 ).

fig. 9 - Variations des concentrations en methyl chlorophyllides (A) et protochlorophyllides (B) en fonction de (d). (C) et (D) : transformations respectives en coordonnées de HILL.

- CO-FACTEURS PHOTOSYNTHETIQUES

Le terme recouvre un ensemble de composés dérivant de la structure quinonique ( plastoquinones, vitamines K, vitamines E ) et participant aux mécanismes de transport d'électron associés à la photophosphorylation.
Les techniques ont été décrites dans des publications antérieures :
M. BOUNIAS, 1969, Chimie Analytique, 51, 76-82, et Thèse d'Etat de Doctorat ès Sciences, Lyon I, n°ordre 98, 262 p.

Les Tableaux 6 et 7 expriment les résultats obtenus respectivement à partir des échantillons de la 1ère et de la 2ème série.

Tableau 6

Tableau 7

S'agissant ici de jeunes feuilles, le dérivé correspondant à la vitamine A est partout absent, sauf dans l'extrait E-1, ce qui confirme les résultats de la 1ère série, mais "recule" l'observation au centre de la trace :
dans l'effet retardé, rien ne subsiste en bordure.

Les chroménols sont dominants dans l'extrait 1, principalement le chroménol-phosphorylé, de même que la quinone du tocophérol.

Les variations du composé 5' ne sont pas interprétables.

Comme pour les chlorophylles et caroténoïdes, des relations quantitatives apparaissent entre les distances et les concentrations, dans le cas de la tocophéryl quinone (Tq), du tocophéryl chroménol (Tc) et du chroménol-phosphorylé (CP). Les courbes illustrées sur la figure 10 ont été analysées en coordonnées bi-logarithmiques par le calcul de régression linéaire sur D = (1+d).

fig. 10 - Variations des concentrations en tocophéryl quinone (Tp), tocophéryl chroménol ( Tc) et chroménol-phosphoryle (C-P) en fonction de la distance "d" au "centre du Phénomène" :

coordonnées naturelles et bi-logarithmiques.
D = (1+d).

Les résultats sont résumés ci-dessous (N = 6 couples de données)

Tableau 8

Les pentes traduisent la cinétique de décroissance des concentrations en fonction de l'éloignement du phénomène :

elles croissent dans le sens quinone --> chroménol --> chroménol-P

Observons que ces équations rappellent celles qui relient la proportion de (Ph A'/Chl. A) à la distance "d" (fig.6) :

la pente bi-logarithmique était alors :
b = - 1,06 (comme pour Tc).

Les chroménols sont des formes inactives par rapport aux quinones, de même que les Chroménol-P par rapport aux Quinols-P :

la phéophytine est elle-même une forme physiologiquement inactive de la chlorophylle.

- LIPIDES NON PHOTOSYNTHETIQUES

La figure 11 illustre quelques chromatogrammes provenant des échantillons de la 1ère série.
Les fractions 1-2-3-7 et 11 correspondent à des dérivés chlorophylliens, et la fraction 5 parait correspondre au pic du chroménol-phosphorylé analysé, avec les co-facteurs.

La fraction 12 et 13, situées respectivement au niveau de tri-glycérides à chaînes courtes (<C16) et à chaînes longues (>C18) présentent des variations caractéristiques :
la fraction 12 est abaissée au voisinage du "phénomène" mais elle est peu dépendante de l'âge de la feuille ; au contraire, la fraction 13, pratiquement absente chez les témoins jeunes est très concentrée chez les feuilles âgées et augmente toujours au voisinage du "phénomène".
Ces observations ont été confirmées par les analyses opérées sur les échantillons de la 2ème série.

fig. 11 - Chromatogrammes des lipides des échantillons de la 1ère série.

Les étalons sont désignés par les abréviations suivantes :

P1=phospho-lipides. MG ; DG ; TG=Mono, Di et Tri-glycérides.
AG=acides gras. St=stéroïdes. EAG=esters d'AG. Est=esters de stéroïdes.
Les chromatogrammes d'extraits correspondent à 1mg de poids frais.
Les courbes en pointillés indiquent la position des pigments chlorophylliens.

- GLUCIDES LIBRES

Les chromatogrammes des extraits de la 1ère série sont illustrés sur la figure 12.

Le saccharose constitue la fraction dominante : sa teneur est toujours abaissée au voisinage du "phénomène" ; cette diminution est moins accentuée dans les feuilles âgées (-15%) que dans les jeunes feuilles (-25%).
Le pic 9 qui correspond aux pentoses varie peu chez les feuilles âgées tandis qu'il diminue très sensiblement dans les jeunes feuilles placées au voisinage du "phénomène".
En revanche, le glucose augmente dans ce dernier cas, ce qui traduit un ralentissement du métabolisme, également moins perceptible dans les feuilles âgées.

 Fig.12 - Chromatogrammes de glucides des échantillons de la 1ère série.
Les étalons sont désignés comme suit :
 1 = raffinose
 2 = gentiobiose
 3 = cellobiose
 4 = maltose
 5 = saccharose
 6 = glucose
 7 = fructose
 8 = sorbose
 9 = xylose
10 = rhammose
11 = digitoxose
 

Les analyses effectuées à partir des échantillons de la 2ème série sont en cours.
Les premiers résultats ne font que confirmer les observations précédentes avec, dans l'extrait 1, ( au centre du "phénomène" ) une augmentation du glucose :

(+300), une légère baisse du fructose ( -15%) et une baisse assez accentuée du saccharose (25% minimum) relativement aux extraits provenant d'échantillons plus éloignés.

- AMINO-ACIDES LIBRES

Les amino-acides et l'ensemble des dérivés aminés de faible masse molaire ont été analysés selon les méthodes décrites dans Analusis,1980, 8, 287-295 et dans l'ouvrage paru chez MASSON, 1983 (Op. Cit.).

Plus de 15 composants ont été séparés, parmi lesquels les suivants ont pu être identifiés : lysine, arginine, histidine, cystéine, acide aspartique, asparagine, acide glutamique, citrulline, thréonine, alanine, proline, valine, tryptophane, iso-leucine et leucine.

Un compose de mobilité comparable à celle de la taurine, un autre de polarité comprise entre celle du glycocolle et celle de la citrulline, et deux autres de polarité voisine de celle de l'acide alpha-amino-butyrique sur silice et respectivement du tryptophane et de la valine sur cellulose ont été mis en évidence.
Ils sont désignés successivement par alpha1, alpha2, alpha3 et alpha4.

(fig. 13).

  1 = lysine
 2 = Arginine
 3 = Histidine
 4 = Ac. Aspartique
 5 = Ac. Glutamique
 6 = Glutamine
 7 = Citrulline
 8 = Thréonine
 9 = Alanine
10 = Proline
11 = Tryptophane
12 = Tyrosine
13 = Valine
14 = Methionine
15 = Phenyl-alanine
16 = Iso-leucine
17 = leucine

fig. 13 - Chromatogrammes d'amino-acides dans les échantillons de la 1ère série.

Dans l'ensemble, les acides aminés tendent à évoluer en fonction inverse des concentrations pigmentaires, comme cela a déjà été démontré sous l'action d'autres formes de traumatismes ( BOUNIAS, 1972, Arabidopsis inf. serv., 9, 13-15 et 1975, Can. J. Bot., 53, 708-719 ).

Toutefois, le compose alpha4, plus abondant chez les feuilles jeunes "Témoins" voit sa concentration diminuer de 50% dans les échantillons situés au voisinage du "phénomène".

D'autres études sont en cours pour approfondir ces résultats ; les données préliminaires obtenues, par ailleurs, à partir des échantillons de la 2ème série montrent des variations concordantes des concentrations de alpha4.

7.5. - DISCUSSION ET CONCLUSIONS -

Les feuilles provenant de plants récoltés au voisinage le plus immédiat du "phénomène" présentent certaines particularités communes aux deux series d'extractions, donc encore perceptibles 40 jours après l'événement :
l'équipement pigmentaire chlorophyllien et caroténoïdien est affaibli de 30 à 50% en formes actives et enrichi en formes inactives ou dégradées.

Les jeunes feuilles subissent la perte la plus importante au niveau du ß carotène (-57%) et de la violaxanthine (-80% !).

Dans tous les échantillons de la 2ème série, les chlorophylles sont partiellement décomposées en formes oxydées, mais les modifications sont plus prononcées au voisinage immédiat du "phénomène".

Dans la plupart des cas, il existe des corrélations quantitatives entre les perturbations observées et la distance des prélèvements au centre du "phénomène" :
les paramètres de régression varient en fonction des différences d'enthalpie libre associées aux transformations.

Dans le cas des glucides et des amino-acides, il apparaît également certaines modifications quantitatives du spectre des divers composants.

Les plus importantes tendent à faire évoluer le contenu des très jeunes feuilles vers une composition plus caractéristique de feuilles âgées.

Les perturbations observées au niveau des pigments photosynthétiques peuvent être examinées par comparaison avec celles produites dans les feuilles cotylédonaires d'Arabidopsis thaliana (crucifère) après exposition des graines à une irradiation gamma ( BOUNIAS, 1973, Arabidopsis inf. serv., 10, 26-27 ).
Les données numériques suivantes montrent qu'il est nécessaire d'appliquer une dose très importante de rayons gamma:

106 rads, pour obtenir des altérations tout au plus équivalentes ou inférieures à celles observées dans les feuilles de Medicago.

Chlorophylle A :  - 30%      violaxanthine :  - 40%
Chlorophylle B :  - 46%      Lutéine :  - 30%
        ß carotène :  - 20%

Il apparaît, en outre, vers 250 K.rads, un composé rouge de mobilité comprise entre celle du ß carotène et celle des phéophytines :

ce composé, de polarité inférieure à celle des chlorophylles, et de spectre décalé vers les longueurs d'ondes croissantes ( lambda max = 490 à 520 nm ) paraîtrait correspondre plutôt à un dérivé réduit de la chlorophylle A, tel que celui décrit par KRASNOVSKII, 1948 ( Dokl. Akad. Nauk. SSSR, 60, 421 ), caractérisé également par une coloration rouge et une bande de Soret décalée à 525 nm.

Un dérivé transitoire présentant un maximum d'absorption à 475 nm a d'ailleurs été décelé par ZIEGER et WITT, 1961, Z. physik. chem., 28, 286, au cours de la réduction chimique de la chlorophylle A, ce qui confirme la relation entre réduction et effet bathochrome.

L'action du rayonnement nucléaire ne présente donc pas d'analogie avec celle de la source énergétique impliquée dans le phénomène observé.

Par contre, une intensification spécifique de la transformation des chlorophylles en phéophytines et des chlorophyllides en phéophorbides ( par perte de Mg++ ) pourrait être liée à l'action d'un champ énergétique de type électrique.

D'autres expériences, actuellement en cours, ont pour objet de compléter les résultats actuels et de tenter d'établir une comparaison des modifications de certaines inter-relations entre pigments et aminoacides, avec celles observées sous l'action de divers autres traumatismes physiques.

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